巴斯德畢赤酵母（以下簡(jiǎn)稱畢赤酵母）能夠高效表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠溆懈鼜?qiáng)的強(qiáng)啟動(dòng)子，即醇氧化酶啟動(dòng)子PAOX。甲醇營養(yǎng)型酵母能將甲醇分解為甲醛和過氧化氫，在此反應(yīng)中參與的酶是醇氧化酶（AOX1和AOX2）。其中，AOX2的表達(dá)量比AOX1低得多，以甲醇為唯一碳源時(shí)，AOX1增至細(xì)胞總蛋白的40%。PAOX1受甲醇誘導(dǎo)和葡萄糖或甘油的抑制。因此，AOX1的表達(dá)受到甲醇的嚴(yán)格控制。
巴斯德畢赤酵母所表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，這是通過把攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒線性化，以同源重組的方式整合到強(qiáng)啟動(dòng)子PAOX1的下游，目的基因一般插入到5’AOX1啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子之間的單克隆位點(diǎn)。
在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中，乙醇氧化酶有兩種基因編碼，即AOX1和AOX2。細(xì)胞中絕大多數(shù)乙醇氧化酶活力有AOX1提供，菌株利用甲醇的速度主要由AOX1基因表達(dá)的AOX1蛋白提供。當(dāng)AOX1缺失，只存在AOX2時(shí)，大部分的乙醇氧化酶活力喪失，這種細(xì)胞利用甲醇能力低，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢的菌株表現(xiàn)型為Muts。存在AOX1，細(xì)胞利用甲醇正常生長(zhǎng)，在甲醇培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，這種菌株表現(xiàn)型為Mut+，這就是甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母表達(dá)兩種Muts和Mut+產(chǎn)生的原理。
GS115、KM71、SMD1168是常用的表達(dá)宿主菌，均為甲醇誘導(dǎo)型。他們都是組氨酸缺陷型，如果表達(dá)載體上帶有組氨酸基因，可以補(bǔ)償宿主菌的組氨酸缺陷，所以可以在不含組氨酸的培養(yǎng)基上篩選重組轉(zhuǎn)化子。在以葡萄糖或者甘油等為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)時(shí)，AOX1基因的表達(dá)受到抑制，而在以甲醇為唯一碳源時(shí)，宿主菌的AOX1基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，使目的基因大量表達(dá)。
畢赤酵母的最適生長(zhǎng)溫度為28-30℃，誘導(dǎo)期間超過32℃，不利于蛋白表達(dá)，并可能導(dǎo)致細(xì)胞死亡。Muts和Mut+菌株在沒有甲醇存在的情況下生長(zhǎng)速率一樣，存在甲醇的情況下，AOX1啟動(dòng)子被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，Mut+較Muts生長(zhǎng)更快（4-5倍）。
酵母表達(dá)產(chǎn)物有胞內(nèi)表達(dá)和分泌到胞外表達(dá)兩種方式，這取決于表達(dá)載體的選擇和構(gòu)建是否帶有信號(hào)肽，可根據(jù)基因表達(dá)的定位及目的選擇合適的酵母蛋白表達(dá)載體。
① 胞內(nèi)表達(dá)載體：主要包括pPIC3、pPICZ、pPSC3K、pHIL-D2等。該類載體將目的基因表達(dá)在胞內(nèi)，可避免酵母的糖基化，適合于通常在胞漿表達(dá)或不含-S-S-的非糖基化蛋白，較胞外分泌表達(dá)水平高但純化相對(duì)復(fù)雜。
② 分泌到胞外表達(dá)的載體：pPIC9、pHIL-S1、pYAM75P等。酵母本身分泌的外源蛋白很少，將外源蛋白分泌到胞外，有利于目的蛋白的純化和積累。常用的分泌信號(hào)序列由89個(gè)氨基酸組成α交配因子的引導(dǎo)。
③ 多拷貝插入表達(dá)載體：pPIC9K、pPIC3.5K。某些情況下，重組基因的多拷貝整合能夠增加蛋白的表達(dá)量。
想實(shí)現(xiàn)表達(dá)重組蛋白使其具體天然的N端，將目的基因直接連接在Kex2蛋白酶切位點(diǎn)之后。Kex2蛋白酶切位點(diǎn)在信號(hào)肽序列中谷氨酸和精氨酸連接處：Glu-Lys-Arg*Glu-Ala-Glu-Ala *位置為Kex2蛋白酶的酶切位點(diǎn)
畢赤酵母能夠高效的表達(dá)外源基因，是因?yàn)槠渚哂袕?qiáng)啟動(dòng)子乙醇氧化酶啟動(dòng)子（AOX1和AOX2）。AOX1和AOX2及其產(chǎn)生的Muts和Mut+表現(xiàn)型前文已經(jīng)敘述過。AOX1受甲醇的誘導(dǎo)和葡糖糖或甘油的抑制。畢赤酵母表達(dá)的外源基因位于酵母染色體上，通過把構(gòu)建的質(zhì)粒/載體線性化（主要采用酶切），通過同源重組的方式整合到啟動(dòng)子AOX的下游，一般是插入到5’AOX啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄終止子信號(hào)之間的單克隆位點(diǎn)。
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